کلون و بیان ترشحی آنزیم dfpase در باسیلوس سوبتیلیس

آفت¬کش¬های ارگانوفسفره برای کنترل آفت¬های کشاورزی استفاده می¬شوند و 38% کل آفت کش های موجود در جهان را شامل می شوند. این ترکیبات استیل کولین استراز را مهار می کنند که منجر به تجمع استیل کولین و در نهایت نقص در اندام و حتی مرگ می گردند. یکی از آنزیم¬هایی که دارای ویژگی سوبسترایی وسیع برای تجزیه ارگانوفسفات¬هاست آنزیم دی ایزوپروپیل فلوروفسفاتاز(dfpase ) می¬باشد که در مغز ماهی مرکب( loligo vulgaris ) یافت شده است. تیمار ترکیبات ارگانوفسفره با استفاده از سوش¬های مهندسی شده حاوی آنزیم dfpase روش مناسبی برای حذف این ترکیبات می¬باشد. در این مطالعه به منظور تسریع تجزیه ترکیبات ارگانوفسفره بیان ترشحی آنزیم dfpaase برای اولین بار در میزبان b. subtilis wb600 بررسی شد. این مدل از بیان آنزیم باعث میگردد محل آلوده مورد نظر سریعتر و با ایمنی بالاتر رفع آلودگی شود. ژن dfpase به کمک pcr از وکتور pet28-inav/n-dfpase تکثیر یافت. محصول pcr بدست آمده در وکتور pwb980 کلون گردید. سوش باکتریایی b. subtilis wb600 مستعد با وکتور نوترکیب ترانسفرم شدند. بررسی بیان ترشحی پروتئین در محیط بسیار غنی به کمک تکنیک sds page باند پروتئینی حدود 35 کیلودالتون را پس از 72 ساعت گرمادهی در دمای 35 درجه و دور rpm 150 نشان داد. مطالعه فعالیت به روش مانیتورینگ فلوراید آزاد شده از تجزیه dfp، u/l3333 فعالیت را نشان داد. نتایج به دست آمده نشان می دهد سوش نوترکیب به منظور تولید تجاری این آنزیم، بسیار کارآمد باشد.